禽白血病及其防控百问百答(一)

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  摘要:过去的二十多年,禽白血病给我国鸡群带来了严重危害。经过连续多年净化,目前禽白血病在我国白羽肉鸡和蛋用型鸡中得到了有效控制。禽白血病的净化是一个复杂的过程,笔者根据多年的研究成果及净化实践,禽白血病的概念、禽白血病病毒的特点和分类、禽白血病发病及传播特点、鸡群禽白血病的预防与控制、种鸡场禽白血病病毒的净化等相关内容,以一问一答的形式系统地进行了呈现。
关键词:禽白血病;禽白血病病毒;鸡;净化
在过去二十多年中,禽白血病给我国各种类型的鸡群带来了很大的危害。经过连续多年采取检疫和净化的措施,我国白羽肉鸡和蛋用型鸡中的禽白血病得到了有效的控制,近三年来不再有典型的病例报告发生,成为我国在近几十年内首个不使用疫苗仅采取种源净化和鸡场生物安全措施有效防控的动物疫病。但在大多数黄羽肉鸡和我国固有的地方品种鸡群中,禽白血病还在流行和蔓延,并造成一些鸡场严重的肿瘤发病死亡。因此,许多黄羽肉鸡种鸡场和地方品种鸡保种场都开始启动了禽白血病净化程序。在国务院颁布的《我国中长期动物疫病防治规划(2010—2020)》中,把禽白血病列为必须净化的疫病之一。
在过去十年中,笔者课题组在协助一些种鸡场开展禽白血病净化的过程中积累了不少资料和经验。为了有助于更多的种鸡场有效地实施禽白血病净化,笔者在过去几年中分别在出版的书籍和《中国家禽》发表文章介绍禽白血病的净化操作程序,如:2015年中国农业出版社出版的《禽白血 病》,《中国家禽》2015年23期发表的我国种鸡场禽白血病净化程序。禽白血病的净化是一个复杂的过程,它不仅涉及兽医技术人员,还涉及企业高管特别是总经理、种鸡场管理人员,也涉及到政府主管部门的官员。但是,在当前信息量爆炸的时代,多数人即使是专业技术人员也不可能系统细读一本书甚至一篇文字较多的技术性文章。为此,笔者将其中的相关内容,并结合过去多年在各地就禽白血病净化的讲座与来自基层鸡场的听众交流过程中的经验,将与种鸡场禽白血病净化相关的主要问题以一问一答的形式展现,以便养鸡业的企业高管、种鸡场管理人员、兽医技术人员很容易从中选择感兴趣的问题仔细研讨。期望该禽白血病及其防控的百问百答能对我国的家禽养殖有所帮助。
1 什么是禽白血病?
答:禽白血病又称之为禽白血病/肉瘤(Leuko.sis/sarcoma),是指由禽C型反转录病毒群的病毒引起的鸡的不同组织、细胞的良性及恶性肿瘤性 疾病。其中,以淋巴白血病(LL)最常见,但近来髓细胞样白血病已成为主要的发病类型。
禽白血病的研究已有100多年的历史,Pev—ton Rous在1911年首先报道了将自然发生的鸡肉瘤滤过液再接种鸡后可诱发同样的肿瘤。由此,Pevton Rous从肿瘤中发现了罗斯肉瘤病毒(RSV,最早发现的一种禽白血病病毒),还证明RSV感染鸡确可诱发肿瘤、在细胞培养上可形成病毒诱发的蚀斑。这是第一次用实验直接证明病毒可以引起肿瘤,发现者由此在1966年获得了诺贝尔医学奖。
2禽白血病在鸡群中流行时能带来多大的经济损失?
答:早在1970年代时,全世界未经净化的鸡群普遍都感染了禽白血病病毒(ALV)。在商业化经营的鸡群中由ALV感染造成的死亡率大约有1%~2%左右,只是偶而可达到20%甚至更高。实际上,随ALV流行株的致病性及鸡群遗传背景不同,不同鸡群自然肿瘤发病率也有一定差异。此外ALV感染除了诱发死亡外,还能在大多数感染鸡造成亚临床感染,并对一些重要的生产性能如产蛋率、受精率和孵化率等产生不良影响。更为重要的是,该病毒可通过种蛋从母鸡传染给后代,这给育种公司带来了更大的挑战。
在1980年代末期在英国白羽肉鸡中出现了J亚群禽白血病,并迅速蔓延到全世界几乎所有的白羽肉鸡公司。由于其传染性和致病性比经典的禽白血病都要强很多,给鸡场特别是种鸡场造成的危害和损失更大。
1990年代初期以来,J亚群禽白血病病毒(ALV—J)也随引进的白羽肉种鸡传人了我国,给我国的养鸡业造成了重大的经济损失。它不仅严重危害了我国白羽肉鸡,又逐渐传人蛋用型鸡、黄羽肉鸡和固有的地方品种鸡等各种类型鸡,严重危害了我国养禽业的健康发展。其中尤以在蛋用型鸡中造成的经济损失最为突出,在2008~2009年大暴发期间,每年大约有6 000万只商品代蛋鸡在开产前后直接由于ALV—J诱发肿瘤死亡或被淘汰。随着ALV—J在黄羽肉鸡中的蔓延和适应,它造成的肿瘤发病率和死淘率也逐渐升高。
3我国养禽业在禽白血病的经验教训是什么?
答:近十年来,我国养禽业和禽病界在防控鸡 群禽白血病方面获得了两个最重要的经验教训:一是必须高度重视鸡群的种源净化,必须对种鸡群的外源性ALV感染实施严格监控和净化,否则其流行和危害的严重性将逐代增强放大;二是只要能掌握ALV及其传播特点和流行规律,只要认真去做,就能做到对种鸡场外源性ALV的净化,并在全国范围内逐步实现对禽白血病的全面有效控制。
4禽白血病病毒属于什么病毒,它的形态特点是什么?
答:禽白血病病毒(Avian leukosis villlses,ALV)属于反转录病毒科、正反转录病毒亚科、仅反转录病毒属的一类病毒。该科病毒的基因组是RNA,以具有反转录酶为特征。其它一些家禽和野鸟能感染ALV,但目前研究最多的是从鸡分离到的ALV,从其它不同鸟类分离到的多种ALV在宿主特异性、抗原性和致病性上都与从鸡分离到的有很大差异。
在感染细胞的超薄切片中,则可显示出病毒的一层外膜和中间膜,及位于病毒粒子的中央的、直径约35~45 nm的电子致密的核芯,这代表了C型反转录病毒粒子典型形态。病毒粒子呈圆球型,总体直径80~120 nm,平均直径约90 nm。有囊膜,表面有直径约8 nm的纤突,这是由病毒囊膜糖蛋白形成的。经过负染的病毒也多为球颗粒,但其形态在干燥条件下很容易变形。
5 ALV基因组的基本结构是什么?
答:ALV病毒粒子中的基因组为单股正链RNA,长度约为7~8 kb左右。在每个有传染性的病毒粒子内有二条完全相同的单链RNA分子,在它们的5L端以非共价键连接在一起,每个单链RNA分子就是病毒的mRNA。每个基因组分子有3个主要编码基因,即衣壳蛋白基因(胖)、聚合酶基因(poZ)和囊膜蛋白基因(env),在基因组上的排列为5’gag—poZ—env。这些基因分别编译病毒群特异性(gs)蛋白抗原和蛋白酶、RNA依赖性DNA聚合酶(反转录酶)和囊膜糖蛋白。在两端还分别有非编码区,其中有一段重复序列及一端独特序列或一端独特序列,这些非编码区的序列具有启动子或增强子的活性。在通过反转录产生的前病毒DNA中,它们又形成了长末端重复序列(Longtenninal repeats,LTR)。迄今为止,已对数个禽反 转录病毒基因组绘制出类似的基因组图。但是,在一些急性致肿瘤性ALV基因组中还可能带有某种肿瘤基因,同时伴随着基因组某些片段的缺失,够成了复制缺陷性病毒。
6 ALV病毒粒子内有哪些酶和蛋白质成分?
答:从ALV三个编码基因909、pof、e删转录产生的原始转录子,经过不同的剪接和翻译后再加工,将产生一系列不同的蛋白质。由觥基因编码一些非糖基化蛋白p19、p10、p27、p12和p15。其中p19又称基质蛋白(MA),而p27是衣壳蛋白(CA),是ALV的主要群特异性抗原即gs抗原(又称Gag)。另外2个蛋白质,p12是核衣壳蛋白(NC),参与基因组RNA的剪接和包装,p15是一种蛋白酶(PR),与病毒基因组编码的蛋白质前体的裂解相关。具有反转录酶,这是包括ALV在内的所有反转录病毒的共同特点。反转录酶存在于核芯内,由多聚酶(p01)基因编码。位于病毒粒子衣壳中的由_poZ基因编码的反转录酶是一个复合体蛋白,由a(68 ku)和b(95 ku)二个亚单位组成,它具有以RNA或DNA作为模板合成DNA的功能即反转录的功能,还有对DNA:RNA杂合子特异性的核酸酶H的活性。它的b亚单位含有一个IN功能区即整合酶(p32),能将前病毒DNA整合进宿主细胞染色体基因组中。另一种由病毒编码的酶是p32pol,它是一种与B亚单位相关的核酸内切酶。囊膜基因编码可糖基化的囊膜蛋白,它包括位于囊膜纤突表面的gp85(Su)和将纤突与囊膜连接起来的gp37(TM)。这两种囊膜蛋白质连接成一个二聚体。
7 ALV在细胞内是如何复制的?
答:同其他病毒一样,ALV必须在特定的易感细胞中复制。但是,ALV在复制过程中,在病毒吸附到易感细胞、其病毒囊膜与细胞膜融合将基因组RNA转人细胞质后,其病毒基因组必须有一个从基因组RNA反转录为前病毒cDNA、前病毒cDNA整合进细胞染色体基因组、再从染色体基因组上转录产生ALV基因组RNA的过程。然后才能象其他病毒一样编码产生病毒蛋白质,并由此装配成病毒粒子,再释放到细胞外。其中从基因组RNA反转录为前病毒cDNA、前病毒cDNA整合进细胞染色体基因组是一个非常复杂的分子生物学过程,参与这一过程的蛋白酶都是由ALV基因 组编码的,有时就存在病毒粒子内。
8 ALV有哪些实验室宿主系统?
答:为了诊断和研究目的,必须要在相应的实验室宿主系统分离培养ALV。对ALV的实验室宿主系统分别有在细胞培养、鸡胚(或其它禽类胚)及SPF鸡或其它鸟类。目前,实验室内最常用的细胞培养分别有鸡胚成纤维细胞(CEF)或来自CEF的可传代的细胞系DF一1细胞。
9 ALV有哪些亚群。是根据什么确定的?
答:在教科书中,根据囊膜蛋白gp85的特异性,ALV有A、B、C、D、E、F、G、H、I和J十个亚群,这是依照其发现和鉴定的年代先后确定的。其中最重要的是从鸡群分离到的A~E五个亚群和J亚群。其他几个亚群则是从其它鸟类发现,如从环颈雉和绿雉中发现F亚群病毒,在Ghinghi雉、银雉及金黄雉中发现G亚群病毒。还分别从匈牙利鹧鸪和冈比亚鹌鹑中分离到H亚群和I亚群病毒。
最近笔者课题组跟据gp85基因序列的同源性比较,又从东亚地区特有的地方品种鸡群中分离和鉴定出新的K亚群。
不同亚群ALV囊膜蛋白gp85的抗原性不同,它们对不同遗传背景来源的细胞易感性不同,当一个细胞被某亚群的ALV感染后就会对同一亚群ALV感染产生抵抗力。因而在经典病毒学时代,要确定一个病毒的亚群,必须要用已知亚群参考病毒做病毒交叉中和试验、病毒干扰试验,同时对不同细胞遗传背景(包括不同鸟类)的细胞做易感性试验。这是一个非常复杂的试验过程,而且在我国现在的条件下,很难拿到所有亚群的参考病毒来做比较试验。由于不同亚群的上述生物学特性都与病毒的囊膜蛋白gp85相关,根据gp85的序列分析基本上就可以判断出一个病毒分离株属于哪一个亚群。
10ALV亚群与致病性有什么关系?
答:在20世纪70年代,鸡群中自然感染并引起肿瘤的主要是A亚群,还有少量病例是由B亚群引起的,而C和D亚群则很少引发自然病例。在20世纪90年代,J亚群ALV(ALV—J)则成为白羽肉鸡的最大危害。严重时可在种鸡开始产蛋前后,由其引起的髓细胞样肿瘤的死淘率可达到10%甚至20%。在2000年后,由ALV—J诱发的髓 细胞样肿瘤又逐渐传人蛋用型鸡和我国自繁自养的地方品种鸡,严重感染的鸡群,肿瘤死淘率可达20%或更高。但是,在同一个亚群内,不同分离株的致病性也可能有差异。
其他亚群如F、G、H和I,只是代表在其它鸟类如野鸡、鹧鸪、鹌鹑发现的内源性ALV,但对这些亚群ALV的致病作用及相关的流行病学还很少有研究报告。
11 我国鸡群中已确定有哪些亚群的ALV?
答:迄今为止,我国从不同类型鸡群的骨髓细胞样瘤或血管瘤病鸡分离到的ALV中,98%以上是J亚群,只是偶尔分离到A、B、C亚群或K亚群,且往往是与J亚群同时分离到。在临床健康鸡,则有J亚群、K亚群,偶尔也有A、B、C、E亚群。
12什么是复制缺陷型病毒?
答:有一些急性致肿瘤性ALV基因组的胖基因、poZ基因或e聊基因可能被某种肿瘤基因完全或部分取代,因而不能单独形成完整的病毒粒子,成为复制缺陷型病毒(Replication—defectivevillls,rd—ALV)。在ALV诱发的急性肿瘤中,就会存在这类复制缺陷型病毒。这些具有急性致肿瘤活性的复制缺陷型病毒由于基因组不完整,单独不能产生与病毒复制相关的全套蛋白质,因此不能在任何细胞上单独生长复制。只有当有其它ALV作为辅助病毒存在时,才能复制并形成病毒粒子。这时,缺陷型病毒的基因组被辅助病毒形成的所有病毒蛋白及病毒外壳所包装,随同辅助病毒释放到细胞外并识别和感染新的易感细胞。在感染的细胞中,它们的基因组有可能复制出前病毒DNA并整合进细胞基因组,也可再转录产生新的缺陷性病毒基因组RNA,但仍然不能独立形成有传染性的病毒粒子。复制缺陷型病毒这个概念是相对于大多数能自我独立复制的ALV,能正常复制的ALV一般都不带有肿瘤基因,通常诱发慢性肿瘤,即肿瘤发生的潜伏期较长,要在感染后好几个月才可能在较小比例的鸡诱发肿瘤。
13什么是内源性禽白血病病毒?
答:这是ALV特有的一个概念,是指存在于鸡染色体基因组上的ALV前病毒基因组或其片段。在1966年就已发现,有一些鸡胚中可检出ALV群特异性抗原但却检测不出游离的ALV。这种群特异抗原基因位于常染色体上。在常染色体上的ALV囊膜蛋白内源性基因与群特异性抗原基因常常是伴随遗传的。几乎所有鸡个体的体细胞和生殖细胞基因组中都带有完整的或缺陷性的ALV前病毒遗传序列,即内源性ALV或ev位点。这种ev位点可按孟德尔法则垂直传播,也称为遗传性传播。迄今为止,已至少识别和鉴定出29个不同的ev位点,每只鸡平均带有5个ev位点。科学家也培育选择出一个不带有ev位点的鸡品系(O系),表明这些位点对于鸡来说不是必须的。这些ev位点在基因结构上与外源性反转录病毒非常类似,但许多ev位点的结构是缺陷型,因而不能产生有感染性的反转录病毒。但也有例外,如ev2,从ev2位点可表达产生没有致病性的E亚群ALV即RAV0株ALV。Ev位点就象一个转座子,可以从基因组的一个位点转移到另一个位点,它们在包括人在内的所有高等生物的基因组上所占的比例很大。这些ev位点一旦活化,就可能与某些疾病相关。
鸡的大多数ev位点的遗传序列与E亚群ALV相关,几乎所有正常鸡都带有完整的或缺陷性的ALV—E基因组。
14什么是外源性禽白血病病毒?
答:这里的外源性ALV的概念是相对于内源性ALV。除了E亚群ALV外,鸡的其他亚群ALV都来自可以自行复制的可感染性病毒粒子的感染。
与内源性ALV相对应,鸡的外源性ALV是指不通过宿主细胞染色体传递给下一代的ALV,包括A、B、C、D、J和K亚群,致病性强的鸡ALV都属于外源性病毒。它们既可以像其他病毒一样在细胞与细胞间以完整的病毒粒子形式传播,或在个体与群体间通过直接接触或污染物发生横向传染,也能以游离的完整病毒粒子形式通过鸡胚从种鸡垂直传染给后代。即它们不是来自鸡染色体基因组上按孟德尔遗传法则遗传的ev位点,而是来自被感染细胞外。目前种鸡场禽白血病净化的目标就是要净化外源性ALV,而不涉及内源性ALV。
当然,在外源性ALV复制周期中,其前病毒DNA也一定要整合进被感染的宿主细胞染色体基因组中,但这种整合不稳定,不会像已知的E亚群内源性ALV基因组那样稳定并能通过生殖细胞逐 代遗传。
要特别注意的是,这里的外源性ALV的概念不同于污染弱毒疫苗的外源性病毒的概念。在弱毒疫苗中,所有不是疫苗病毒本身的其他病毒都是污染造成的,这些病毒也都称为外源性病毒(包括污染的ALV),这是在疫苗生产过程中污染造成的,但与遗传无关。
15内源性ALV—E有致病性吗?
答:几乎没有致病性,或者说其致病性非常非常弱,它是不会诱发肿瘤的。而且它们在体内和细胞上的复制能力都很弱。但是,能表达或产生完整的ALV—E病毒粒子的鸡往往对其他外源性ALV的抵抗力较差,更容易发生外源性ALV诱发的禽白血病肿瘤。
16细胞染色体基因组的内源性禽白血病毒的ev位点能产生游离病毒吗?
答:能,但不是所有的ev位点都能产生游离的有传染性的ALV。只有那些含有ALV完整基因组的ev位点可能自发性地表达内源性ALV—E。目前发现的能产生传染性病毒的内源性ALV都属于E亚群。如性染色体z上与决定快慢羽相关基因K紧密连锁的ev21位点。从这个ev21可产生传染性病毒EV2l。此外,还有其他一些ev位点也能转录产生ALV—E的传染性病毒粒子,如ev2、evl0、evll、evl2、evl3、evl4、evl6等。还有些位点不含有完整的ALV—E基因组,它们有时也能表达部分基因,如ALV—E的肛g、en",而且可能用一些检测手段检测出来,如ELIsA。但是,由于这些位点缺乏形成病毒所需要的完整基因,因此不会产生有传染性的完整病毒粒子,如ev3。要强调说明的是,这些特定位点是稳定地整合进鸡细胞基因组,因此才会按孟德尔法则遗传。这种ev位点从亲代到子代的传播就称为遗传性传播,它不同于处在感染状态鸡的垂直传播或水平传播。当然,由ev位点如ev21完整表达产生的ALV—E也能按通常的垂直传播或水平传播的方式,完成从亲代到子代或从个体到个体的传染。
17 内源性ALv对禽白血病的诊断和检测会有什么干扰作用?
答:虽然E亚群内源性ALV通常没有致病性,但会干扰对禽白血病的鉴别诊断。种鸡群净化ALv,在我国现阶段主要是净化外源性病毒,而内 源性ALV表达的p27就会在泄殖腔棉拭子、胎粪、精液甚至蛋清检测p27时产生假阳性,有时假阳性率还很高。了解鸡群有无ALV感染,在现阶段也只是指外源性病毒感染。当然,在鸡的基因组上带有ev21等完整的或不完整的ALV—E基因组片段,并不代表就一定会表达,这决定于每一只鸡个体的多种遗传生理因素,甚至同一个体不同生理条件。例如,海兰褐祖代的AB系、父母代的公鸡、商品代母鸡中的一半个体都带有ev21,但一般都不表达p27,或至少表达的量低至检测不出的水平。美国海兰公司和安伟捷公司的专家都保证他们的祖代鸡蛋清中可表达能检测出水平的p27的个体不到1%,这是在ALV净化过程中多年选择的结果。至于未经这种选择的其它品系,特别是我国的地方品系,鸡基因组上带有ev2l等完整的或不完整的ALV—E基因组片段与表达p27的比例关系,则很可能不一样。目前还没有与此相关的资料,这需要我国学者加强这方面的研究。除了ALV—E基因组片段以外,在一些鸡的基因组上,也可能存在ALV—J的囊膜糖蛋白(gp85)的ent)基因的片段,甚至还有ALV—A en秽的片段。
18为什么慢羽鸡都带有可以产生游离病毒的内源性ALV—E?
答:在引进的白羽肉鸡和蛋用型鸡中,很多品系可以用快慢羽来鉴别雏鸡的性别。由于快慢羽的形成是与性染色体z上基因K的活性密切相关,有些鸡之所以形成慢羽,是因为在该染色体上插入了与基因K紧密连锁的ev21位点。由于这个ev21的插人使基因K不能表达活性,从而干扰了羽毛发育形成慢羽。而从这个ev21位点就可自发性地产生传染性病毒EV2l。这是最典型的也是最常见的内源性ALV—E产生的形式。
19外源性ALV的不同毒株的致病性相同吗?
答:不仅不同,而且有时差别很大。首先,ALV—J的致病性和传染性要比其他亚群ALV强得多。即使是同一个亚群的ALV,其差别也很大,这显然与ALV基因组易发生变异有关。一旦基因组上与致病性相关的序列发生变异后,就可能影响其致病性。此外,一个毒株可能对某一种遗传背景的鸡致病性较强,但对其他不同遗传背景的鸡的致病性就可能较弱,相反也是一样。

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